劃重點(diǎn)：
1.iPSC培養(yǎng)過(guò)程中不建議使用抗生素，抗生素會(huì)影響細(xì)胞的活性和分化潛能。
2.iPSC培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)與其它細(xì)胞隔離，兩次傳代后檢測(cè)支原體。
01基質(zhì)膠用于多孔板的包被：
（1）將Gelnest?基質(zhì)膠(干細(xì)胞專用)置于冰中并在4℃融化，使用預(yù)冷的移液管或吸頭混合基質(zhì)膠至均勻狀態(tài)。
注：GelNest?基質(zhì)膠是由小鼠腫瘤組織中提取的基底膜成分制備而成，包含的主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原蛋白硫酸肝素糖蛋白等，更含有多種多種生長(zhǎng)因子。這些成分可以提供細(xì)胞黏附、分化和增殖所需的支持和信號(hào)，模擬生理環(huán)境中基底膜的特性，從而進(jìn)一步模擬生理環(huán)境中的細(xì)胞信號(hào)通路和互動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率和效果。
（2）在冰上，將基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)液按照1:80或1:100的比例混勻，例如取1mL基質(zhì)膠加入80mL或100mL DMEM培養(yǎng)液中，使用預(yù)冷的移液管混合至均勻狀態(tài)。
注：可根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況調(diào)整稀釋比例。
（3）將6孔板置于冰上，按照每孔1mL向6孔板中加入稀釋后的基質(zhì)膠。
（4）將6孔板置于37℃孵育過(guò)夜。
注：一般情況下，孵育1小時(shí)即可使用，但過(guò)夜孵育的細(xì)胞培養(yǎng)效果更好。
（5）使用前吸出未結(jié)合的基質(zhì)膠。
注：需確保移液管的尖端不會(huì)刮傷涂層表面。
02 Y-27632 （ROCK抑制劑）溶液的配制
將Y-27632 溶于PBS中，配制成10mM的Y-27632溶液，例如取2.47mg Y-27632溶于1mL PBS中，即得1mL 10mM Y-27632溶液。
注：Y-27632的工作濃度為10μM。
03配制含Y-27632的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液（如mTeSR?1或TeSR?-E8?）
取Y-27632溶液與mTeSR?1培養(yǎng)液按照1:1000的比例混勻，例如取10μl Y-27632溶液加入10mL mTeSR?1培養(yǎng)液中，即得10mL含10μM Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液。
04 iPSC復(fù)蘇：
（1）將凍存的iPSC置于37℃水浴迅速解凍，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，用DMEM培養(yǎng)液沖洗凍存管兩次并轉(zhuǎn)移至離心管中，與管中細(xì)胞合并，室溫300×g離心5分鐘。
（2）棄上清，用2mL含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液重懸iPSC，隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠包被好的6孔板的1個(gè)孔中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注：建議將每支復(fù)蘇的細(xì)胞(約100萬(wàn)個(gè))轉(zhuǎn)移至6孔板的1個(gè)孔中培養(yǎng)使細(xì)胞存活率最大化。
（3）第二天對(duì)iPSC進(jìn)行換液，將含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液更換為不含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液。
注：可使用耐思新推出細(xì)胞復(fù)蘇儀替代原始細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程，細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)間短，細(xì)胞存活率高。
05 iPSC傳代：
注：iPSC細(xì)胞生長(zhǎng)至單層后會(huì)迅速分化并死亡，為保持其活性和多能性，需在長(zhǎng)滿前進(jìn)行傳代。
（1）去上清，用1mL PBS洗滌1次，加入1mL適當(dāng)?shù)募?xì)胞消化液
（2）將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵育3分鐘。顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞脫落，若細(xì)胞仍附著，可以用手輕輕拍打培養(yǎng)板底部使細(xì)胞脫落。
（3）將消化下來(lái)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，用DMEM培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)板表面兩次并轉(zhuǎn)移至離心管中，與管中的細(xì)胞合并，室溫300×g離心5分鐘。
（4）棄上清，用含Y-27632的mTeSR?1培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠包被好的6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
06iPSC凍存：
NEST生物樣本庫(kù)系列含有全規(guī)格細(xì)胞凍存管及凍存液，操作簡(jiǎn)單，安全無(wú)菌。
（2）參考細(xì)胞凍存液的相關(guān)步驟進(jìn)行細(xì)胞消化。
（3）計(jì)數(shù)，棄上清，加入適量?jī)龃嬉海悦抗?mL凍存液（約100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞）分裝至凍存管中。
（4）將細(xì)胞凍存管放置于可逐步降低溫度的NEST程序降溫盒內(nèi)并放置在-80℃冰箱內(nèi)，確保冷卻速度約為1℃/分鐘。通常冷卻速度不宜快于0.5℃/分鐘。
（5）放置在-80℃冰箱內(nèi)約24小時(shí)后轉(zhuǎn)移至液氮?dú)庀嘀斜４妗?img src="http://cell-nest.bcdn8.com/Resource/editor/2023/12/01/1f1b2a9463f54ac78a03ffc66ef2fc36.png" style="max-width: 100%; height: auto;" data-filename="/">
iPS細(xì)胞的成功誘導(dǎo)給細(xì)胞治療及再生醫(yī)學(xué)研究開辟了全新的道路。相信在不久的將來(lái)，iPSC技術(shù)能快速突破瓶頸，NEST也將持續(xù)研發(fā)新品，推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)的蓬勃發(fā)展，為患者帶來(lái)新生的希望！
