間充質干細胞屬于成體干細胞，可在體外通過不同的方法干預下下誘導分化為骨、軟骨及其他結締組織，因其來源廣泛，分離無創傷，較低的免疫原性、生長周期短等特點，是組織工程種子細胞的重要來源。干細胞的誘導分化一方面是干細胞鑒定的主要方法，另一方面也是干細胞功能學研究的主要途徑。采用體外條件培養基誘導培養下，人間充質干細胞應能夠分化為成脂肪、骨、軟骨細胞。成骨分化經茜素紅染色法鑒定。
實驗前準備：
試劑：PBS，成骨誘導分化培養基，茜素紅
耗材：NEST細胞培養皿，NEST普通吸頭，NEST微量離心管
設備：CO2培養箱，顯微鏡
一、接種骨髓間充質干細胞：
取對數生長期的細胞，按照2×105cells/cm2的細胞密度接種至包被后的細胞培養皿中，將接種好的細胞培養皿放到37℃，5% CO2細胞培養箱培養，定期觀察細胞增殖狀態，當細胞融合度達60-70%時，棄掉上清，加入成骨誘導分化培養基。
二、細胞分化誘導：
每2-3天進行換液（定期觀察是否有污染），再放入37℃，5% CO2細胞培養箱中培養約2-3周，并注意觀察細胞形態變化。根據細胞鈣鹽結晶析出和鈣質結節形成的情況，決定終止細胞誘導的時間，進行下一步染色鑒定。
三、細胞固定：
用吸頭（確保吸取充分）吸去培養基使用適量1×PBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液細胞培養皿底面，室溫固30-60min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。
四、茜素紅染色：
加入適量茜素紅染液染3-5min，吸去茜素紅染液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細胞干燥。
五、誘導評估：
顯微鏡下觀察成骨染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，鈣質結節會與茜素紅染料結合后呈現紅色或橘紅色。
圖c 間充質干細胞成骨誘導分化,茜素紅染色顯示鈣結節..
